シングルセルレパトア解析｜受託解析
シングルセルレパトア解析は、細胞集団内の各細胞のトランスクリプトーム解析に加え、 T 細胞受容体 (TCR) や B 細胞受容体 (BCR) 遺伝子の配列を解析することで、T 細胞や B 細胞の多様性と動態をシングルセルレベルで解析できる最新の技術です。
免疫細胞のTCRやBCRは非常に多様な配列のレパートリー(=レパトア)を持つことが知られており、組織中で高頻度に存在している受容体は、がん細胞やウイルス等の標的抗原を認識する可能性が高いと言われています。
TCRやBCRの配列を決定するレパトア解析とシングルセルRNA解析を組み合わせることで、標的抗原特異的な免疫細胞の経時的な変化や、さまざまな組織における免疫細胞の発現プロファイルを解析することができます。
この技術を活用することにより、がんや感染症の予後を予測するマーカー遺伝子の探索や、標的抗原特異的な抗体医薬品の開発に繋がると期待されます。
実験のポイント
シングルセルレパトア解析では、末梢血等をそのまま解析する場合もありますが、T細胞やB細胞をセルソーター等で分離して解析することが一般的です。分離した場合でも106以上の細胞数が必要となります。
また、シングルセルRNAseqと同様に、細胞の生存率が非常に重要です。死細胞が溶解すると周囲にRNAが遊離し、分析時のバックグラウンドノイズの一因となり、シングルセルデータの品質を著しく低下させる要因となります。一般的には生存率90%以上が推奨され、クリアな解析結果を得るためには、80%程度以上の生存率が必要です。
シングルセルの分画やバーコード付けなどを行うシングルセル解析システムとしては、BD Rhapsody™システムや10x Genomicsのシステムが利用されています。
解析のポイント
実験で測定した、各細胞の発現データおよびVDJ領域のデータを統合的に解析します。まず、データのクオリティを確認した上で、細胞をクラスタリングし、マーカー遺伝子から免疫細胞のサブタイプを同定します。その後、各クラスターについて遺伝子発現プロファイルとTCRおよびBCRのレパトアを解析します。
・クオリティチェック
| リード数が少ない細胞やミトコンドリアDNAの割合が高い細胞を、バイオリンプロットを使用して識別します。 これらの細胞はクオリティが低い可能性があるため、解析から除外します。 | |
・クラスタリングとUMAPによる次元削減
| UMAP ( Uniform Manifold Approximation and Projecton ) という次元削減の手法を用いて、シングルセルを発現プロファイルに基づいてクラスタリングし二次元にプロットします。同じクラスター内の細胞は、類似した発現プロファイルを示しています。 | |
・Expansion Cloneの発現パターンの解析
| クローナルに増殖している細胞が属するクラスターを解析します。図右端のバーは各クローンの数を示しています。クラスターごとの免疫細胞サブタイプの情報と組み合わせることで、抗原特異的なT細胞およびB細胞のサブタイプを確認することができます。 | |
・クラスタごとのクローン数解析
| T細胞およびB細胞の可変領域の中でも多様性に富むCDR3領域の塩基配列をリスト化し、各クラスターで存在する割合を解析します。 同じクローンの細胞が増えているクラスターや、クラスター間で共通するクローンを確認することができます。 |
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・α多様性解析
| α多様性とは集団内での多様性を意味し、レパトア解析においてはクラスター内で多様なTCR/BCRレパトアが含まれている場合に高値を示します。例えば、病態が進行している状態ではクローナルな細胞が増えることで、α多様性が低下する傾向が見られます。クラスターごとにα多様性を解析することで、病態が進行している組織で増加することが知られている細胞を持つクラスターを確認することができます。 | |
サービス内容
【シングルセルRNAシーケンスおよびレパトア解析】| ○ TCRまたはBCRレパトア解析と併せたシングルセル 5’RNA-seq |
| ○ 10x Genomics社 Chromiumによるライブラリ調製 |
| ○ Illumina社 NovaSeq6000による3億リードのシーケンシング |
| ○ Cell Rangerによる発現定量およびレパトアContigファイルの作成 |
| ○ 解析レポート、中間報告および最終報告（手法解説、結果解釈のディスカッション） | ||
| ● 発現変動遺伝子の群間比較解析 | ||
| 細胞クラスターごとの特徴遺伝子検討、サンプル間発現比較解析 | ||
| ● レパトア解析 | ||
| 多様性解析、Expansion Cloneの発現パターンの解析、クラスタごとのクローン数解析 | ||
解析結果レポート例
サンプル要件 / 注意事項
サンプルタイプ：細胞
- 凍結状態であること。
- 細胞数は106細胞以上であること。
- 融解後の細胞の生存率が90%以上推奨。
- 細胞は分散もしくは単離してください。
- 細胞培養に最適化された培地に懸濁してあること。
- 細胞サイズが直径30μm以下であること。
- 40μmのフィルターにかけてください。
- 凍結の際にはセルバンカー等を用いてください。
- ※ ヒトおよびマウスサンプルのみの対応となります。
- ※ 納品にかかる費用 (クラウドまたはHDD) を別途頂戴します。
ご利用の流れ
- 研究目的、サンプル情報をヒアリングし、お見積りを作成します。
- ご発注後、サンプルを準備いただき、シーケンスを行います。
- 中間報告会にて、途中結果の報告および解析方針の確認、内容についてのディスカッションを行います。
- 最終報告会にて、結果の報告および内容について、ご報告します。
「バイオインフォマティクスに関するお悩み・ご要望」をお聞かせください。
安心してご利用を開始していただけるよう、各担当スタッフがサポートします。
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