7月, 2023 | amelieff

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2023.07.31

夏季休業のお知らせ

平素は格別のお引き立てをいただき厚くお礼申し上げます。
弊社では、誠に勝手ながら下記日程を夏季休業とさせていただきます。

【夏季休業期間】
2023年8月11日（金）　～　2023年8月16日（水）

休業期間中にいただいたお問合せについては、営業開始日以降に順次回答させていただきます。
皆様には大変ご不便をおかけいたしますが、何卒ご理解の程お願い申し上げます。

2023.07.20

シングルセルレパトア解析｜WET&DRY【新製品発売記念キャンペーン】

論文作成には欠かせない
データ解析まで込みの
スペシャルプライス

139万円/サンプル
（税込1,529,000円）

キャンペーン
お問合せ

サービス内容

【シングルセルRNAシーケンスおよびレパトア解析】

○ TCRまたはBCRレパトア解析と併せたシングルセル 5’RNA-seq

○ 10x Genomics社 Chromiumによるライブラリ調製

○ Illumina社 NovaSeq6000による3億リードのシーケンシング

○ Cell Rangerによる発現定量およびレパトアContigファイルの作成

【バイオインフォマティクス解析】

○ 解析レポート、中間報告および最終報告（手法解説、結果解釈のディスカッション）
	● 発現変動遺伝子の群間比較解析
		細胞クラスターごとの特徴遺伝子検討、サンプル間発現比較解析
	● レパトア解析
		多様性解析、Expansion Cloneの発現パターンの解析、クラスタごとのクローン数解析

サンプル要件 / 注意事項

サンプルタイプ：細胞

凍結状態であること。
細胞数は10⁶細胞以上であること。
融解後の細胞の生存率が90%以上推奨。
細胞は分散もしくは単離してください。
細胞培養に最適化された培地に懸濁してあること。
細胞サイズが直径30μm以下であること。
40μmのフィルターにかけてください。
凍結の際にはセルバンカー等を用いてください。

※ ヒトおよびマウスサンプルのみの対応となります。
※ 納品にかかる費用 (クラウドまたはHDD) を別途頂戴します。

ご利用の流れ

研究目的、サンプル情報をヒアリングし、お見積りを作成します。
ご発注後、サンプルを準備いただき、シーケンスを行います。
中間報告会にて、途中結果の報告および解析方針の確認、内容についてのディスカッションを行います。
最終報告会にて、結果の報告および内容について、ご報告します。

キャンペーン
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シングルセルレパトア解析とは

　シングルセルレパトア解析は、細胞集団内の各細胞のトランスクリプトーム解析に加え、 T 細胞受容体 (TCR) や B 細胞受容体 (BCR) 遺伝子の配列を解析することで、T 細胞や B 細胞の多様性と動態をシングルセルレベルで解析できる最新の技術です。
　免疫細胞のTCRやBCRは非常に多様な配列のレパートリー(=レパトア)を持つことが知られており、組織中で高頻度に存在している受容体は、がん細胞やウイルス等の標的抗原を認識する可能性が高いと言われています。
　TCRやBCRの配列を決定するレパトア解析とシングルセルRNA解析を組み合わせることで、標的抗原特異的な免疫細胞の経時的な変化や、さまざまな組織における免疫細胞の発現プロファイルを解析することができます。
　この技術を活用することにより、がんや感染症の予後を予測するマーカー遺伝子の探索や、標的抗原特異的な抗体医薬品の開発に繋がると期待されます。

実験のポイント

　シングルセルレパトア解析では、末梢血等をそのまま解析する場合もありますが、T細胞やB細胞をセルソーター等で分離して解析することが一般的です。分離した場合でも10⁶以上の細胞数が必要となります。
　また、シングルセルRNAseqと同様に、細胞の生存率が非常に重要です。死細胞が溶解すると周囲にRNAが遊離し、分析時のバックグラウンドノイズの一因となり、シングルセルデータの品質を著しく低下させる要因となります。一般的には生存率90%以上が推奨され、クリアな解析結果を得るためには、80%程度以上の生存率が必要です。
　シングルセルの分画やバーコード付けなどを行うシングルセル解析システムとしては、BD Rhapsody™システムや10x Genomicsのシステムが利用されています。

解析のポイント

　実験で測定した、各細胞の発現データおよびVDJ領域のデータを統合的に解析します。まず、データのクオリティを確認した上で、細胞をクラスタリングし、マーカー遺伝子から免疫細胞のサブタイプを同定します。その後、各クラスターについて遺伝子発現プロファイルとTCRおよびBCRのレパトアを解析します。

・クオリティチェック

　リード数が少ない細胞やミトコンドリアDNAの割合が高い細胞を、バイオリンプロットを使用して識別します。これらの細胞はクオリティが低い可能性があるため、解析から除外します。

・クラスタリングとUMAPによる次元削減

　UMAP ( Uniform Manifold Approximation and Projecton ) という次元削減の手法を用いて、シングルセルを発現プロファイルに基づいてクラスタリングし二次元にプロットします。同じクラスター内の細胞は、類似した発現プロファイルを示しています。

・Expansion Cloneの発現パターンの解析

　クローナルに増殖している細胞が属するクラスターを解析します。図右端のバーは各クローンの数を示しています。クラスターごとの免疫細胞サブタイプの情報と組み合わせることで、抗原特異的なT細胞およびB細胞のサブタイプを確認することができます。

・クラスタごとのクローン数解析

　T細胞およびB細胞の可変領域の中でも多様性に富むCDR3領域の塩基配列をリスト化し、各クラスターで存在する割合を解析します。
　同じクローンの細胞が増えているクラスターや、クラスター間で共通するクローンを確認することができます。

・α多様性解析

　α多様性とは集団内での多様性を意味し、レパトア解析においてはクラスター内で多様なTCR/BCRレパトアが含まれている場合に高値を示します。例えば、病態が進行している状態ではクローナルな細胞が増えることで、α多様性が低下する傾向が見られます。クラスターごとにα多様性を解析することで、病態が進行している組織で増加することが知られている細胞を持つクラスターを確認することができます。

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2023.07.20

シングルセルレパトア解析｜データ解析【新製品発売記念キャンペーン】

免疫細胞のクローナリティの解析を行うサービスです。抗原を認識している可能性が高いクローンの発現プロファイルの解析や、レパトアの大きいクローンにおけるIR可変部位の配列解析を行います。

25万円/サンプル
（税込275,000円）

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データ解析内容

【発現定量解析とサンプル間比較解析】

● クオリティコントロール

● 正規化、次元削減

● データ統合

● クラスタリングおよびUMAP上の可視化

● クラスタごとの特徴遺伝子の探索

● 各クラスタにおけるサンプル間発現比較解析

【TCR/BCRレパトア解析】

● α多様性解析

● Expansion Cloneの発現パターンの解析

● クラスタごとのクローン数解析

【オプション解析】

● 各クローンにおけるマーカー遺伝子解析

● エピトープ解析

解析結果レポート例

受入れデータ・納品物

受入れデータ形式

下記データ形式からご選択いただけます。

Seven Bridge (BD RhapsodyTMシステム) の出力データ形式（AIRR）
cellranger vdj (10x Genomics)の出力データ形式

※FASTQからの場合には別途費用を頂戴します。

納品物

解析結果レポート（最終報告）
データ解析結果（PDF、Excel）

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2023.07.20

第88回バイオインフォマティクス勉強会「Nextflowで始めるNGSデータ解析ワークフロー」

　アメリエフは創業当時より「バイオインフォマティクスの活用を促進し研究を加速させる」ミッションを掲げ、定期的にバイオインフォマティクス勉強会を開催しています。
バイオインフォマティクス勉強会は、データが解析されていく様子をバイオインフォマティシャンの目線で体験できるイベントです。初学者のデータ解析に対する敷居を下げる工夫をしておりますので、エッセンスをお持ち帰りいただきお役立ていただけましたら幸いです。今回は、バイオデータ解析のシステムやインフラ環境の切り口で「Nextflowで始めるNGSデータ解析ワークフロー」をテーマに開催いたします。

▼オンデマンド動画を視聴する▼

【講義内容】
　Nextflowとは、解析ツールを連続して実行するワークフロー管理システムです。これまで次世代シーケンサの解析に必要なソフトウェアを個別にインストールして利用することが一般的でしたが、Dockerコンテナやワークフローでパッケージ化された形で論文やWEBで紹介されることが増えています。
特に、ワークフロー言語Nextflowの活用が世界的にひろまっており、Nextflowを利用したパイプランやクラウド環境が公開されており、活用できるようになりつつあります。
　今回は、Nextflowに興味はあるが触ったことがない方向けに、概念から、インストール、基本操作、実践まで順を追ってかみ砕いて解説します。

【こんな方におすすめ】
・論文で紹介されているNextflowを使ったパイプラインを活用したい方
・ワークフロー言語とはなにか把握したい方
・解析を自動化したい方

勉強会終了後には無料相談会を実施いたします。
無料相談のご要望が多いため、初めてご相談される方のみの、完全予約制とさせていただいております。
お申込みの際にご希望をご記入ください。

開催要項

テーマ	Nextflowで始めるNGSデータ解析ワークフロー
講師	アメリエフ株式会社　代表取締役CEO　山口昌雄
日程	2023年8月2日（水）17:00-17:30
場所	オンライン（Zoom）
定員	300名定員を超えた場合、お申し込みを受け付けられない場合がございます。予めご了承ください。
参加費	無料
申込締切	2023年8月1日（火）12:00
主催	アメリエフ株式会社

お申込みフォーム

※お申込みを締め切りました。
　またの機会にご参加をお待ちしております。
※同業他社さまにはご参加をご遠慮頂いております。
　申し訳ございませんが、ご理解のほど宜しくお願い致します。

2023.07.10

WESがん変異解析｜WET&DRY【新製品発売記念キャンペーン】

シーケンスに加えて、
論文作成には欠かせない
データ解析・作図まで込みの
スペシャルプライス

14.9万円/症例
（税込163,900円）

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サービス内容

【Whole Exome シーケンス】

○ ライブラリ調製

○ 腫瘍組織　12Gb/サンプル（NovaSeq6000 PE150）

○ 正常組織　 6Gb/サンプル（NovaSeq6000 PE150）

【バイオインフォマティクス解析】

○ 解析レポート、最終報告（手法解説、結果解釈のディスカッション）

○ 体細胞変異検出：クオリティコントロール、マッピング、体細胞変異（SNV/InDel）検出、遺伝子情報アノテーション

○ データベースアノテーション及び計算予測：dbSNP、gnomAD、ClinVar、PROVEAN、SIFT、phastCons

○ 高次解析（3症例, 6サンプル以上の場合）：Oncoplot作成、Tumor Mutation Burden 算出、Driver gene解析

※サンプル数によって対応可能な組み合わせ数が異なりますのでご相談ください

サンプル要件 / 注意事項

サンプルタイプ：genomic DNA

推奨DNA量（ng）	液量（µL）	濃度（ng/µL）	純度
300以上	20以上	20以上	OD260/280 ≥ 1.8 OD260/230 ≥ 1.8 no degradation, no contamination

※ 過度のRNAの混入がないこと。タンパク質・フェノール等の不純物の混入がないこと。
※ 再懸濁溶液は、純水 ( DNase/RNase-free )、EBまたはlow TE ( < 0.1 mM EDTA )
※ シーケンシングは海外（シンガポール）にて実施します。オプションとして国内でのシーケンシングも対応可能です。
※ 海外輸送費・納品にかかる費用 (HDD) を別途頂戴します。
※ 対象生物種はヒトのみとなります。

ご利用の流れ

研究目的、サンプル情報をヒアリングし、お見積りを作成します。
ご発注後、サンプルを準備いただき、シーケンスを行います。
報告会にて、高次解析結果の報告および解釈について、ご報告します。

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WESがん変異解析とは

　がんの診断や治療薬の効果・副作用の予測、治療抵抗性や予後の予測において、ゲノム変異がバイオマーカーとして活用されつつあります。特に体細胞変異は治療薬の効果を予測するマーカーとなり得ます。近年急速にゲノム配列のシーケンシングコストが低下しており、マーカーを探索するために全ての遺伝子領域における変異を網羅的に解析するホールエクソームシーケンス（WES）を活用することが一つの有効な手段となっています。
　がんと正常サンプルのシーケンスデータを比較することで体細胞変異を検出し、既知のアノテーションを付与し、変異が蓄積している遺伝子と臨床情報の関連性を可視化するなどの解析を通じて、バイオマーカーの候補を検討することができます。

実験のポイント

　一般的には、がん変異解析には同一患者のがん組織と正常組織のゲノムDNAが必要となるため、それぞれの組織のサンプルを準備します。がん組織のゲノムDNAは、手術検体試料や病理診断の際の生検試料の一部をサンプルとして利用することが多いため、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルからの抽出が主となります。ただし、FFPEの検体は試料作成までの時間によってDNAの品質の低下をもたらす可能性があるため、組織抽出から固定までの時間を短くする必要があります。また、ホルマリン固定液の組成、濃度、pHなどの条件も重要となります。さらに、ホルマリンに長期固定すると、DNAの塩基置換が生じて、それが変異の擬陽性として検出されます。
　一方、新鮮凍結（FF）サンプルは、DNA抽出に非常に適していますが、サンプル調製と保存に費用がかかります。

　次世代シーケンサ（NGS）でシーケンスする際に、採取したがん組織のサンプルに多くの正常細胞が混入していると、がん細胞由来のゲノムDNAの割合が相対的に減少するため、検出精度の低下を招く可能性があり、米国がんゲノム解析プロジェクト等ではがん細胞含有率は30%以上であることが推奨されてます。
　一方、正常組織のゲノムDNA の採取は、おもに末梢血から密度勾配遠心法を用いて分離された単球やリンパ球を含む単核球（PBMC :Peripheral Blood Mononuclear Cells）より採取されます。
　がんのWESでは、がん組織のゲノムを高解像度で決定する必要があるため、がん組織のサンプルを約 x100（12Gb）、正常組織のサンプルを約 x50（6Gb）程度のカバレッジでシーケンスするなど、がん組織のサンプルを厚めにシーケンスすることが推奨されています。

変異解析のポイント

　NGSによるシーケンスで得られた配列は、FASTQというファイル形式で保存されます。この配列を参照ゲノム配列にマッピングします。この結果は、BAM形式ファイルで保存され、IGV (Integrative Genomics Viewer)などのゲノムブラウザを用いて可視化できます。
　腫瘍組織のシーケンスデータには、生殖細胞系列の変異も含まれているため、正常組織のシーケンスデータと比較し、生殖細胞系列の変異を除いた体細胞変異を検出します。その際は、正常組織の混入により腫瘍組織の純度は100%でないことや、腫瘍組織に複数のサブクローンが存在すること、コピー数変異が存在することを考慮し、それぞれの変異について、アレルの割合（variant allele frequency, VAF）の変動を許容して体細胞変異を検出します。
　検出された変異は、どの遺伝子上の変異か、どの程度翻訳後のアミノ酸に影響を与えるかなどの生物学的なアノテーション（意味づけ）、疾患との関連が報告されているかなど公共データベースと照らし合わせる方法でナレッジベースの分析を行い、着目すべき変異を絞り込みます。

【変異抽出結果の例】

・IGVによる変異の可視化

　解析によって得られたマッピング情報（BAM形式）と体細胞変異情報（VCF形式）は、フリーの可視化ツールであるIGVに読み込ませることで、シーケンスの様子と候補となる変異を視覚的に把握することができます。特に、腫瘍組織割合やサブクローンの影響によって生じた低VAFの様子を直感的に理解するために役立ちます。

高次解析のポイント

・Oncoplot（オンコプロット）

　遺伝子ごとに観測された変異の種類、サンプル全体に占める割合を要約・可視化することで、患者群に共通する遺伝子や変異の特徴を視覚的に把握することができます。さらに、遺伝子変異を臨床情報のカテゴリごとに分けてプロットすることで、臨床的な特徴と関連している特定の遺伝子変異の有無を探索することができます。

・TMB解析（Tumor Mutation Burden 解析）

　遺伝子変異量（TMB）とは、がん細胞に蓄積した体細胞変異の総量を示す値で、百万塩基あたりの変異塩基数で表されます。TMBは、がんの種類や発生メカニズムにより特徴的になることが知られているほか、免疫チェックポイント阻害剤の治療効果予測にも用いられています。

・Driver gene解析

　発がんやがんの悪性化の直接的な原因となるような遺伝子をドライバー遺伝子と呼びます。既知のドライバー遺伝子に変異が存在するかを解析することで、がんの原因遺伝子を推測することができます。既知の遺伝子として、TCGA（The Cancer Genome Atlas）など公共データベースで取りまとめられているリストを用います。

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2023.07.10

WESがん変異解析｜データ解析【新製品発売記念キャンペーン】

論文作成には欠かせない
データ解析のみの
スペシャルプライス

5.8万円/症例
（税込63,800円）

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データ解析内容

【体細胞変異検出】

● データのクオリティコントロール
● 参照ゲノム（hg38）へのマッピング
● 体細胞変異（SNV/InDel）検出
● 遺伝子情報アノテーション
	○ 生物学的アノテーション (snpEff)
	○ 集団遺伝学的データベースアノテーション(dbSNP, gnomAD, ClinVar)
	○ 計算予測アノテーション(PROVEAN, SIFT, phastcons)
● エクセル形式への変換